KAJIAN KASUS MKM IPB 2009

DINAMIKA PERUBAHAN  MORFOLOGI Cryptococcus neovormans SELAMA INFEKSI PADA PARU-PARU hewan percobaan
Abstrak

Patogenesa infeksi Cryptococcus neoformans telah diteliti secara ekstensif sehubungan dengan inflamasi dan perubahan patologi, tetapi informasi yang ada tentang morfologi sel yeast selama perjalanan infeksi sangat sedikit. Paru-paru murin yang terinfeksi Cryptococcus neoformans secara mikroskopik elektron telah menunjukkan  bahwa ketebalan dinding sel meningkat seiring waktu infeksi, tetapi perbedaan ini hanya sebagian yang dicatat dengan peningkatan diameter sel. Dua jam post infeksi, dinding sel yang bermelanin lebih tebal daripada sel yang tanpa melanin, dan dinding sel yeast menjadi gelap seiring waktu, hal ini akibat konstribusi melanin yang dapat menebalkan dinding sel. Sejumlah sel yang heterogen muncul, dengan menunjukkan adanya bentuk pembesaran dinding sel tersebut. Sedangkan ukuran penebalan sel C. neoformans strain ATCC 24067 (Serotipe D) teramati penuh, untuk sel C. neoformans strain H99 (Serotipe A) dan 3.501 (serotipe D) dibagi menjadi dua populasi yaitu bentuk pembesaran dinding sel dan bentuk mikro. Berbeda dengan heterogenitas selular, epitope yang diproteksi oleh mAb protektif pada kapsul glucuronoxylomannan (GXM) ditemukan di setiap saat infeksi. Mikroskop Imunoelektron dengan menggunakan mAb untuk mendeteksi GXM memperlihatkan reaktivitas dengan struktur intraseluler, dimana minimal sebagian sintesis polisakarida kapsuler terjadi dalam sitoplasma. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa: (i) Dinamika infeksi yang baik untuk morfologi sel yeast; (ii) Pembesaran dinding sel muncul di jaringan selama infeksi; (iii) Dinding sel menghitam dan menebal selama infeksi, sehubungan dengan sintesis melanin selama infeksi dan (iv) Epitop GXM ditemukan dalam kapsul, dinding sel dan sitoplasma, konsisten dengan sintesis polisakarida secara intraselular. Sejumlah sel  C. neoformans  dalam jaringan dalam keadaan yang sangat dinamis, dimana sistem kekebalan tubuh harus menghadapi sel-sel dengan berbagai karakteristik selama infeksi.

Pendahuluan

Cryptococcus neoforman adalah agen penyebab Cryptococcocis, infeksi cendawan ini mengancam jiwa manusia (Review oleh Mitchell & Sempurna, 1995). Cryptococcocis merupakan penyakit komplikasi yang relatif sering dengan HIV pada tahap akhir infeksi (Currie & Casadevall, 1994) dan berhubungan dengan keadaan imunosupresif lainnya, seperti haematologic malignancies, collagen vascuar diseases dan terapi steroid. Infeksi C. neoformans melalui per inhalasi (Levitz, 1991). Pada penderita imunokompeten, infeksi sering tanpa gejala dan terbatas pada paru-paru. Namun, pada pasien dengan gangguan imunitas, penyebaran ekstrapulmoner ke sistem saraf pusat dapat terjadi dan dapat menyebabkan meningoencephalitis. Cryptococcocis  tidak dapat disembuhkan pada pasien AIDS karena terapi yang ada tidak memberantas infeksi dalam penekanan kasus imunosupresif (et Zuger al., 1986).

 Infeksi C. neoformans bersifat kronis pada manusia dan hewan percobaan. Kemampuan C. neoformans untuk bertahan dalam jaringan dan kekebalan penderita belum diketahui dengan pasti. Ada bukti yang cukup kuat bahwa ketidakmampuan penderita  untuk mengeliminasi hasil infeksi dari gangguan dengan mekanisme pertahanan penderita pada polisakarida kapsuler, yang dapat ditemukan dalam jumlah berlebihan di jaringan (Casadevall & Perfect, 1998). Namun, kemungkinan bahwa populasi C. neoformans di jaringan penderita mengalami perubahan yang berhubungan dengan ketidakmampuan respon imun penderita untuk mengeliminasi infeksi. Untuk patogen lainnya, variasi antigenik adalah mekanisme penting untuk menghindari serangan pertahanan penderita. Baru-baru ini, C. neoformans telah terbukti mampu mengalami perubahan morfologi seluler melalui perubahan fenotipe secara  in vitro maupun in vivo (Goldman et al., 1998). Untuk sel C. neoformans, beberapa ultrastruktural penelitian telah memberikan informasi yang sangat rinci tentang struktur sel, dinding sel dan kapsul (Al-Doory, 1971; Cassone et al., 1974; Mochizuki et al, 1987.; Sakaguchi et al., 1993). Dari analisa sampel segar, peningkatan ketebalan dinding sel, ukuran sel, ukuran kapsul dan aktivitas sekretori vakuola telah dicatat dalam perbandingan yeast secara in vivo dan in vitro (Sakaguchi et al., 1993; Takeo et al, 1973.). Namun, informasi  relatif sedikit dari ultrastruktur  sel C. neoformans selama infeksi jaringan, atau pada sintesis dari polisakarida kapsuler.

Feldmesser et al. (2000a)  meneliti  ultrastruktural tentang patologi dan respon penderita terhadap infeksi Cryptococcus pada paru-paru  murin. Penelitian ini memfokuskan pada identifikasi lokasi replikasi C.neoformans dalam jaringan dan menetapkan bahwa yeast ini adalah patogen intraselular fakultatif yang menginfeksi paru-paru murin. Selama penyelesaian penelitian  itu, Feldmesser et al. (2000a)   mencatat perbedaan  waktu morfologi sel C. neoformans di paru-paru mencit yang terinfeksi. Ketersediaan bagian jaringan dari berbagai tahap infeksi memungkinkan morfologi sel yeast berubah selama infeksi. Perubahan morfologi sel yeast yang terkait dengan infeksi kronis. Analisis perubahan selama infeksi dengan menggunakan mikroskop cahaya pada ukuran sel, ketebalan dinding sel dan penampilan dinding sel. Selanjutnya, dengan mikroskop immunoelectron menggunakan mAbs yang mengikat glucuronoxylomannan (GXM), komponen utama dari polisakarida kapsuler menunjukkan perbedaan pola-pola intraselular yang mengikat pada strain serotipe D dan memberikan informasi tentang sintesis polisakarida. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa morfologi sel-sel yeast bervariasi selama infeksi, sehingga terjadi
perubahan dinamis yang dapat memberikan informasi sehubungan dengan kemampuan
organisme ini untuk bertahan dalam jaringan.

METODE

C. neoformans

Strain ATCC 24067 (serotipe D) sering digunakan untuk  percobaan karena telah digunakan dalam penelitian sebelumnya tentang patologi paru-paru (Feldmesser et al., 1998; Feldmesser &  Casadevall, 1997). Terbatas pada percobaan yang dilakukan dengan menggunakan  strain acapsular Cap 67, derivat dari  strain  3.501 (serotipe D) (Jacobson & Tingler, 1994) dan H99 (serotipe A), tipe strain untuk C. neoformans var. grubii (Franzot et al., 1999).  Isolat disimpan  pada 80 ⁰C. Kultur  dimulai dengan inokulasi pada Sabouraud  dexstrosa broth (Difco) dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 30°C dengan cara dihomogenkan. Satu percobaan untuk melihat melanin yeast secara in vitro, C. neoformans ditumbuhkan pada medium  (15 mM glukosa, 10 mM MgSO%, 13 mM glycine, 3.0 µM vitamin B1, pH 5,5) dengan atau tanpa 1. mM L-dopa (Sigma) pada suhu 30°C selama 13 hari. Kultur dicuci 3x dalam phosphate-buffered saline steril, dihitung dengan menggunakan haemocytometer, dan penghitungan dikonfirmasi dengan kultur pada Sabouraud dexstrosa agar. Satu kultur pertumbuhan yeast dan dipersiapkan dengan cara mencampur Trump's fixation (paraformaldehyde 4% dan 1% glutaraldehid dalam 0,1 M buffer fosfat) dan siap untuk EM, seperti yang dijelaskan di bawah ini.

Infeksi pada Murin

Mencit SPF C57BL/6, BALB/c dan A/JCR diperoleh dari National Cancer Institute (Bethesda, MD, USA); mencit 129/SvEv  diperoleh dari Taconic Farms (Germantown, NY, USA). Pada  masing-masing percobaan, mencit berjenis kelamin yang sama. Mencit berumur 6 sampai 10  minggu di anastesi dengan 65 mg natrium pentobarbital kg-¹ dan diinokulasi secara intratracheal dengan dosis 10⁴  atau 10⁸ sel  dalam 0,05 ml PBS steril (dosis yang digunakan adalah dosis rendah10⁴  dan dosis tinggi 10⁸ sel  dalam 0,05 ml PBS steril) (Feldmesser & Casadevall, 1997). Inokulum tertinggi digunakan untuk eksperimen pada mencit yang dibunuh sebelum 24 jam post infeksi untuk memfasilitasi visualisasi sel yeast dalam jaringan oleh EM. Semakin rendah inokulum digunakan untuk eksperimen di mana mencit mati dalam 24 jam atau lebih post infeksi. Dalam percobaan berikut,  strain mencit menindikasikan dalam kurung waktu terinfeksi bersamaan dengan strain 24067, kecuali di tempat yang ditentukan, dan mati: (i) 5 menit atau 2 jam setelah infeksi (BALB/c); (ii) 24 jam, 48 jam, 7 hari atau 28 hari setelah infeksi (C57BL/6); infeksi (iii) 13 hari setelah dengan 10¹ atau 10⁶  sel yeast (129/SvEv); (iv) 14 hari setelah infeksi (A/JCR), (v) 14 hari setelah infeksi (C57/BL6); (vi) 24 jam setelah infeksi strain 24.067, Cap 67 atau 3501 (C57/BL6); (vii) 14 hari setelah infeksi dengan strain 3.501 (C57/BL6); (viii) 2 jam atau 14 hari setelah infeksi dengan H99 strain (C57/BL6), dan (ix) 2 jam setelah infeksi dengan strain 24.067 ditumbuhkan dalam medium minimal dengan atau tanpa L-dopa (C57/BL6). Dalam setiap percobaan, dua mencit dipelajari untuk setiap kelompok. Secara keseluruhan, penelitian ini meliputi data dari 36 mencit. Pada saat yang ditunjukkan dalam eksperimen individu, mencit dietanasi secara dislokasi leher. Paru-parunya dipisahkan dan dicuci dengan Trump’ fixative  untuk EM.

Mikroskop

Untuk EM, jaringan blok dan sel setelah difixasi dengan 1% osmium selama 1 jam, didehidrasi dalam ascending ethanol (30 - 100%), dicuci 2x dengan acetonitrile,  kemudian diinfiltrasi dan disimpan dalam araldite-Epon (Feldmesser et al., (1997). Setelah dilihat pada mikroskopis cahaya bagian terwarnai  1 µm toluidin-blue, bagian ultrathin diwarnai dengan uranyl acetat dan lead cytrat dan di periksa dengan mikroskop elektron JEOL 100S atau 100 CX. Minimal ada 5 yang tidak  terkontanminasi pada masing-masing kelompok mencit dan data dikumpulkan untuk dianalisa. Setidaknya 22% dari pengukuran  sel yeast berasal dari masing-masing mencit, kecuali determinasi selama 13-14 hari, dimana 7 - 37% dari nilai-nilai berasal dari masing-masing empat percobaan. Pengukuran dinding sel terbatas pada sel-sel yeast bagian dekat tengah, seperti ditunjukkan oleh tepi dinding sel. Untuk lokalisasi Cryptococcus intraselular, polisakarida kapsuler menggunakan immunogold, imunohistokimia dengan menggunakan 2H1 mAbs (IgG1), 12A1 (IgM) atau 13F1 (IgM), mAbs murin yang mengikat GXM komponen polisakarida, seperti dijelaskan oleh Casadevall et al. (1998) dan Feldmesser et al. (2000b). Bagian Ultrathin jaringan paru-paru diinkubasi pada 10% H2O selama 10 menit, dicuci dengan PBS, kemudian disaturasi dalam larutan jenuh natrium periodate selama 10 menit, dicuci dengan PBS dan diblokir dengan 2% goat serum selama 1 jam. Jaringan diinkubasi semalam dalam 5 µg primer mAb ml-1 dalam goat serum 2% pada suhu 4 °C. Sebagai kontrol, jaringan diinkubasi di IgG1 murin (Sigma) atau PC-140,  IgM mAb yang mengikat phosphorylcholine (IgM) (Thammana & Scharff, 1983). Jaringan yang sudah dicuci PBS dengan goat serum 2% dengan 0-1% gelatin (60 Bloom unit) dan 0-0,1% Tween 20 dan kemudian diinkubasi di biotin-conjugated goat anti-mouse IgG1 atau IgM (2,5 µgml-1) (Southern Biotechnology Assosiation) selama 1 jam. Setelah dicuci, jaringan diinkubasi pada 10 nm gold-terkonjugasi untuk streptavidin (Goldmark biologi) pencairan dengan perbandingan 1:30 dalam 1% bovine serum albumin selama 2 jam pada suhu kamar, dicuci dan difixasi dengan 2% glutaraldehyde. Ketika perbandingan dibuat antara strain C. neoformans atau selama pelabelan dari strain yang sama dengan mAbs yang berbeda, sampel immunolabelling dilakukan secara bersamaan. Semua sampel dilakukan pelabelan minimal dua kali. Analisis data dilakukan dengan menggunakan spreadsheet Excel paket perangkat lunak. Setelah di analisa variansnya, perbandingan data berpasangan maka  analisa dilakukan dengan menggunakan metode t-test dengan alpha  disesuaikan dengan tingkat koreksi Bonferonni.

HASIL

Diameter sel yeast, ketebalan dinding sel, kapsul volume dan volume sel diukur pada 5 menit, 2 jam, 24 jam, 48 jam, 7 hari, 14 hari dan 28 hari post infeksi (Tabel 1 dan Tabel 2).  Pengukuran terhadap  ketebalan dinding sel melanin C. neoformans juga dilakukan dengan menginfeksikan ke dalam paru-paru murin pada 2 jam dan sel C. neoformans dipersiapkan sebagai penginfeksi inokulum (Tabel 1). Dari data berpasangan menunjukkan tidak adanya perbedaan dalam value yang diperoleh dari mencit pada eksperimen individu, kecuali pada penelitian mencit 28 hari post infeksi (data tidak ditampilkan). Ketebalan dan diameter (tidak termasuk kapsul) dinding sel yeast disiapkan sebagai inokulum untuk menginfeksi adalah lebih kecil daripada sel yeast 5 menit post infeksi. Diameter sel yeast yang sama pada 5 menit dan 2 jam post infeksi menunjukkan bahwa sebagian besar sel-sel yeast di paru-paru berasal dari inokulum penginfeksi. Rasio sel ketebalan dinding dan diameter sel lebih rendah pada infeksi inokulum pada 5 menit, perbedaan ketebalan dinding sel tidak hanya pada fungsi ukuran sel yeast. Setelah 2 jam, mean dan median ketebalan dinding sel C. neoformans meningkat dengan umur pengukuran infeksi sampai 28 hari. 

Minimal sebagian peningkatan dalam  ketebalan dinding sel kembali mempengaruhi  peningkatan ukuran dari diameter sel yeast, seperti dinding sel ketebalan bervariasi secara langsung dengan diameter sel yeast (Gbr. 1).  Namun, untuk memperhitungkan kemungkinan peningkatan proporsional dengan ketebalan dinding sel dalam kaitannya dengan ukuran sel, diameter dinding sel juga dibagi dengan diameter sel. Hal ini karena rasio meningkat dari 2 jam hingga 28 hari, dan meningkat lebih tinggi secara signifikan dari value 2 jam setiap saat dari 48 jam dan seterusnya. Dengan demikian, berarti ketebalan dinding sel dari C. neoformans meningkat sehubungan dengan waktu infeksi dan bukan hanya hasil dari ukuran sel meningkat. Data tersebut untuk 13 - 14 hari infeksi  pada Tabel 1 adalah dikumpulkan dari empat percobaan dengan menggunakan tiga strain mencit. Tidak ada perbedaan value yang diperoleh dari dua percobaan yang digunakan mencit C57/BL6, atau antara mencit A/JCR dan 129/SvEv yang terinfeksi dengan dosis sel 10¹ atau yeast 10⁶.  Namun,  rasio ketebalan dinding sel yeast dan ketebalan dinding diameter sel yeast lebih tinggi pada C57/BL6  dari pada A/JCR dan 129/SvEv (data tidak ditampilkan).

Namun, perbandingan data dari masing-masing individu pada percobaan dari 2 jam setelah infeksi menunjukkan ketebalan dinding sel meningkat secara signifikan. Sejak sel melanin C. neoformans dilaporkan selama infeksi murine (Nosanchuk et al., 1999), hipotesis bahwa peningkatan ketebalan dinding sel mungkin terkait dengan melanisasi. Untuk mengevaluasi kemungkinan ini, sel melanin diperoleh dengan cara menumbuhkan C. neoformans pada medium minimal dengan l-dopa diinokulasi pada paru-paru dan ketebalan dinding sel diukur. Ketebalan dinding sel melanin dalam jaringan paru-paru 2 jam post inokulasi intratracheal  secara signifikan lebih besar dari sel yang tumbuh dalam medium minimal tanpa l-dopa. Untuk memperoleh bukti tambahan untuk melanin dalam jaringan sebagai penjelasan untuk ketebalan dinding sel, dilakukan evaluasi dengan menggunakan mikroskop cahaya tanpa pewarnaan terhadap dinding sel selama mengalami perubahan warna dalam jaringan. Dengan meningkatkan waktu post infeksi dengan sel non melanin, sel dinding Cryptococcosis menjadi semakin hitam (Gbr. 2).

Selain perubahan ketebalan dinding sel, pencatatan juga dilakukan terhadap  munculnya populasi sel heterogen selama infeksi. Pengamatan yang mencolok adalah munculnya pembesaran dinding sel  C. neoformans  di  jaringan paru-paru yang terinfeksi 24 jam post infeksi (Gbr. 3). Sel berkisar hingga 28 µm diameter. Pembesaran dinding sel C. neoformans ditemukan hampir secara eksklusif di ruang ekstraselular. Pada setiap saat 2 jam post infeksi, ada rentang yang luas dalam diameter sel yeast  yang mewakili kesempurnaan ukuran antara bentuk terkecil dan bentuk pembesaran dinding sel. Demikian pula, peningkatan berbagai ukuran dan varians antara sel-sel yang ditemukan di total volume dan volume kapsul yeast (Tabel 2). Semua waktu infeksi, ada dimensi kapsul sel C. neoformans yang berhubungan dengan pengukuran pada 5 menit dan 2 jam. Sebaliknya, pemeriksaan sel disiapkan sebagai inokulum penginfeksi menunjukkan bahwa dari 317 yeast diperiksa dengan hasil magnifikasi rendah  x 7500, tidak ada yeast  memiliki diameter sel > 3.3 µm (rentang: 1.1 -3.3 µm). Dengan demikian, munculnya pembesaran dinding sel yang berukuran heterogenitas dari inokulum infeksi. Pengamatan ini menunjukkan bahwa infeksi C. neoformans pada paru-paru mencit dikaitkan dengan munculnya heterogenitas populasi sel yeast yang luar biasa untuk berbagai ukuran sel dan kapsul. 

Untuk menentukan apakah pengamatan yang dilakukan dengan strain 24067 itu berlaku bagi serotipe A strain, mencit terinfeksi dengan strain H99 dan bagian paru-paru dipelajari 2 jam dan 14 hari setelah infeksi. Untuk strain H99, mean
ketebalan dinding sel selama infeksi meningkat tidak signifikan (berarti ketebalan dinding sel 2 jam adalah 0 ,20  ± 0,04 vs 0,31  ± 0,3 µm untuk  14 hari;  P=0,269; n=12 untuk 2 hari, n= 48 untuk 14 hari. Namun, tidak seperti strain 24067, yang diproduksi sel yeast mewakili kelangsungan ukuran sel antara bentuk-bentuk yang lebih kecil dan yang mengalami pembesaran dinding selnya , untuk strain H99 dan strain serotipe D kedua (3501), lebih dua populasi  menurun secara draktis yang dapat dibagi menjadi dua kelompok bentuk sel yang mengalami pembesaran dinding selnya  dan bentuk mikro. Pemeriksaan dengan pewarnaan 1 µm toluidine-blue menunjukkan bahwa pada 14 hari post infeksi, persentase rata-rata yeast yang bentuk-bentuk giant adalah 69,7± 20,3% dan 70,5±27,4% untuk masing-masing strain H99 dan strain 3501 (untuk H99, 20 kali pemanenan yang dihitung dengan magnifikansi x200; untuk strain 3501 dilakukan penghitungan pemanenan sebanyak 13 kali). Karena ketebalan dinding sel dari strain  H99 dalam bentuk mikro banyak terlihat pada 2 jam, berarti ketebalan dinding sel tidak berbeda secara signifikan pada pengukuran dari dua populasi.

Ketersediaan bagian jaringan dari perbedaan waktu infeksi memungkinkan penyelidikan apakah itu epitope dikenali oleh antibodi pelindung selama infeksi. Penandaan sel-sel dari jaringan yang diperoleh dari mencit yang terinfeksi dari 2 jam hingga 28 hari menunjukkan kehadiran gold partikel di tiga lokasi. Tanpa diduga, penelitian ini juga memberikan informasi tentang sintesis kapsul, karena muncul dalam  beberapa yeast, selain itu ditemukan dalam struktur kapsul dengan pewarnaan immunogold intraselular. Untuk mempelajari lokasi sintesis kapsul, pelabelan immunogold dengan 2H1 mAb dilakukan pada jaringan paru-paru yang diperoleh dari mencit terinfeksi dengan strain 24067 selama 2 jam hingga 28 hari. IEM menunjukkan adanya epitope tidak hanya dalam kapsul, tetapi juga di dinding sel Cryptococcus  dan sitoplasma (Gbr. 4), di mana tampak lokal terutama untuk struktur vacuolar membran-bound. Untuk jaringan yang diperoleh dari mencit yang terinfeksi selama 48 jam, sama dengan pola pelabelan yang terlihat ketika mAbs IgM 12A dan 13F1 digunakan. Untuk strain 3501, pelabelan jaringan dari tikus yang terinfeksi selama 24 jam dengan menghasilkan 13F1 mAb memproduksi pola dan intensitas sebanding dengan label yang terlihat pada strain 24067 (Gbr. 5). Namun, mAbs 2H1 dan 12A1 berlabel baik bagian kapsul dan intraseluler strain 3501 kurang intensif dibandingkan strain 24067. Untuk menentukan apakah epitope itu ada pada sel acapsular, pelabelan immunogold adalah Cap 67 dilakukan. Untuk Cap 67, hanya sesekali ada gold partikel   ketika mAbs 2H1 atau 12A1, yang mengikat epitope yang sama, digunakan. Namun, untuk 13F1 mAb, gold label ada di dinding sel. Sangat jarang gold partikel   pada bagian-bagian dari ketiga strain berlabel dengan kontrol atau IgG-140 PC Abs, atau pada bagian normal paru-paru dari mencit yang terinfeksi pada 5 menit yang diberi label dengan mAb 13F1, menunjukkan pelabelan yang spesifik.

 

DISKUSI

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menetapkan apakah karakteristik sel yeast berubah selama infeksi C. neoformans pada paru-paru murin dan mengidentifikasi karakteristik sel yeast tentang mekanisme  C. neoformans yang dapat menyebabkan infeksi kronis yang di akhiri dengan kematian pada mencit. Hasil penelitian menunjukkan proses yang sangat dinamis dimana terjadi perubahan besar pada sel C. neoformans selama infeksi pada murin eksperimental. Perubahan morfologi berpotensi relevan dengan patogenesa Cryprococcus secara in vivo, bentuk selular baru muncul dari seleksi dan atau perubahan di stimulasi oleh pertumbuhan kondisi jaringan. Varian generasi  baru yang berbeda telah hadir pada sel efektor kekebalan penderita mungkin akan menyebabkan infeksi persisten.

Penebalan dinding sel terjadi di awal perjalanan infeksi dan dipertahankan selama infeksi kronis. Sakaguchi et al. (1993) melaporkan bahwa dinding sel C. neoformans dalam jaringan yang lebih tebal daripada sel yang tumbuh secara in vitro. Namun, peningkatan normalisasi ketebalan dinding sel dipertahankan selama perubahan diameter sel, demikian menunjukkan suatu penebalan secara progresif dinding sel selama infeksi. Hipotesa dari penelitian ini adalah mekanisme peningkatan ketebalan dinding sel oleh melanisasi secara in vivo dimana sel C. neoformans mensintesis melanin selama infeksi (Nosanchuk et al., 1999). Untuk mengevaluasi kemungkinan ini dilakukan perbandingan ketebalan dinding sel melanin dan sel non melanin. Sel C. neoformans tumbuh  di media l-dopa dengan dinding sel tumbuh lebih tebal dari pada sel nonmelanin, hal ini disebabkan oleh peningkatan ketebalan dinding sel akibat proses melanisasi. Ditemukan bahwa  proses melanisasi dari sel C. neoformans secara in vivo adalah progresif dan peningkatan ketebalan dinding sel diamati pada penelitian ini dalam beberapa hari. Analisa secara mikroskopis cahaya terlihat bagian jaringan yang tidak terwarnai yaitu dinding sel Cryptococcus menjadi semakin gelap selama infeksi, ditemukan adanya tanda pembentukan melanin. Meskipun melanin dalam dinding sel Cryptococcus mungkin bersifat amorf (Nosanchuk et al., 1999), adanya tambahan bahan ini dapat menyebabkan peningkatan ketebalan dinding sel. Dinding sel yang mengalami melanisasi dapat melindungi sel yeast dari zat antimikroba penderita (Wang & Casadevall, 1994).

Dalam mengevaluasi ketebalan dinding sel, sumber kesalahan yang dapat berdampak pada pengukuran. Pertama, sumber kesalahan dari hasil pengukuran gambar sel yang kurang bulat, sebagai pengukuran ketebalan dinding sel pada sel dekat sasaran akan menghasilkan nilai lebih besar dari pengukuran sel dekat garis tengah. Oleh karena itu, pengukuran dinding sel dilakukan hanya pada yang muncul jelas/tajam dan memiliki ketebalan relatif konstan pada seluruh selnya. Hindari sel yang bagian tepinya kabur dan dengan berbagai ketebalan. Sumber kesalahan ini berasal dari rata-rata ukuran dan bentuk dari suatu populasi sel yang tidak terdistribusi normal. Untuk strain 24067, ukuran sel muncul secara terus-menerus, sedangkan untuk H99, ada yang jelas dua populasi sel yang berbeda tajam dalam ukuran. Untuk H99, rata-rata dinding sel dari semua sel tidak menghasilkan peningkatan ukuran karena varians meningkat dipengaruhi oleh ukuran pembesaran dinding sel. Sumber kesalahan ketiga adalah oleh fiksasi, pewarnaan dan pengolahan jaringan.dinding sel berubah ketika perbandingan sel dalam kultur jaringan 5 menit post infeksi. Rasio ketebalan dinding sel untuk diameter sel dalam inokulum menginfeksi adalah sama dengan pada 2 jam, mungkin perbedaan reflek osmotik diantara kondisi kultur dan paru-paru, atau awal perubahan yang cepat dalam yeast sebagai respon terhadap infeksi. Atau, perbedaan ketebalan dinding sel dicatat antar sel tercampur dari kultur in vitro dan dari jaringan 5 menit post infeksi mungkin membaik pada struktur dinding sel dalam jaringan paru-paru dengan cara serupa dengan yang terlihat untuk bentuk kapsul (Feldmesser et al., 2000b). Terlepas dari penjelasan, perbedaan ketebalan dinding sel antara sel-sel yeast in vitro dan dalam jaringan diperoleh 5 menit post infeksi tidak mempengaruhi kesimpulan dari penelitian ini karena relevan semua perbandingan pengukuran terlibat sel dalam jaringan. Selain itu, semua sampel diproses dalam bentuk identik dan setiap kesalahan dengan metode persiapan sampel harus berlaku untuk semua kelompok yang dibandingkan. Ada sedikit variabilitas dalam pengukuran yang dibuat antara mencit pada individu percobaan, dengan pengecualian mencit C57BL/6 pada 28  hari post infeksi, waktu di mana mencit tersebut telah mengembangkan respon kekebalan granulomatosa. Penemuan  variabilitas terlambat, tapi tidak lebih awal, mungkin reflek individu berbeda setelah infeksi dalam mengendalikan organisme tersebut. Selanjutnya, dalam jaringan yang diperoleh 2 jam post infeksi, tidak ada perbedaan dalam pengukuran sel yeast yang dibuat pada mencit C57/BL6 atau BALB/c. Namun, suatu perbedaan dilihat pada bagian yang diperoleh dari strain yang berbeda pada mencit  pada 13 hari atau 14 hari post infeksi. Karena kedua A/ JCR dan 129/SvEv lebih rentan terhadap  infeksi Cryptococcus paru-paru daripada mencit observasi C57BL/6 (Feldmesser et al., 1998), replikasi strain yeast pada mencit relatif muda dimana dinding sel yeast lebih tipis. Namun, korelasi dinding sel dengan respon inflamasi penderita memerlukan penyelidikan lebih. Strain 24067, ukuran dinding sel meningkat selama infeksi tetapi secara umum pengamatan ini untuk strain Cryptococcus ini tidak diketahui.

Morfologi sel C. neoformans pada jaringan terinfeksi lebih heterogen daripada ketika tumbuh in vitro. Heterogenitas morfologi sel C. neoformans baik ukuran kapsul dan ukuran sel yeast. Munculnya pembesaran dinding sel mecolok dalam observasi. Sel-sel terutama yang ditemukan di ekstraselular, jauh lebih besar dari makrofag jaringan. Sebaliknya, sel-sel dengan kapsul yang lebih kecil biasanya ditemukan di dalam vakuola makrofag. Diduga, munculnya pembesaran dinding sel menimbulkan masalah berat bagi sel fagositik. Pembesaran dinding sel Cryptococcus telah dilaporkan dari dua kasus penyakit manusia, yang terisolasi dari paru-paru dan dari cairan  cerebrospinal lainnya (Cruickshank et al., 1973; Love et al, 1985.). Laporan histopatologi pada kasus infeksi primer paru-paru pada manusia tersebut jarang menunjukkan gejala. Namun, yang seperti telah diuraikan bahwa bentuk-bentuk pembesaran dinding sel memiliki relevansi dengan patogenesis penyakit manusia. Mekanisme keragaman  morfologi selular tidak diketahui, tapi mungkin melibatkan perubahan fenotipik, perbedaan fase pertumbuhan, dan atau perbedaan nutrisi antar in vivo dan dalam kondisi in vitro (Goldman et al., 1998). Pola heterogenitas dalam ukuran sel yeast bervariasi antara strain C. neoformans. Meskipun ukuran kapsul meningkat secara signfikan selama infeksi, tidak semua sel menunjukkan kapsul yang lebih besar dan populasi sel dengan kapsul besar dan kecil hidup berdampingan dalam jaringan. Heterogenitas terjadi pada awal program infeksi dan terus menerus dipelajari. Munculnya  bentuk pembesaran dinding sel  dan heterogenitas ukuran sel menunjukkan bahwa sistem kekebalan tubuh harus menghadapi sel-sel dengan berbagai karakteristik selama infeksi. Variasi ini dapat memberikan kontribusi kepada kesulitan dalam mengendalikan infeksi ini.

Mengingat penelitian ini untuk pengembangan terapi antibodi untuk Cryptococcus manusia dan variabilitas yang melekat dalam sel-sel C. neoformans dari mencit yang terinfeksi kronis, evaluasi terhadap epitope apakah dikenali oleh  2H1 mAb pada semua tahap infeksi. mAb 2H1 berikatan pada kapsul sel yeast  saat infeksi, yang menyebabkan bahwa heterogenitas sel yeast kehilangan epitope yang tidak konsekuen. Selama penelitian ini, beberapa pewarnaan antibodi terjadi intraseluler. Karena sangat sedikit yang diketahui tentang lokasi sintesis kapsul dalam C. neoformans (Doering, 2000), maka penelitian ini tentang lokasi reaktif epitope mAb dalam sel yeast. Meskipun penelitian sebelumnya  freeze-etching yang konvensional (Takeo et al., 1973) dan metode cepat freeze-deep etching (Sakaguchi et al., 1993) telah menyarankan bahwa prekursor yang disintesis dalam vakuola sitoplasma atau partikel lapisan dinding sel diakumulasi, tidak ada hubungannya antara sintesis kapsul dengan sel dinding. Dalam penelitian ini ini, label immunogold dengan mAb untuk GXM menunjukkan kehadiran epitope tidak hanya pada kapsul, tapi juga di dinding sel Cryptococcus dan sitoplasma, di mana tampak lokal terutama untuk struktur vacuolar membran-bound. Komponen kapsul berisi epitope yang dikenali  oleh  mAb 2H1 mungkin disintesis secara intraselular dan diekspor melalui dinding sel, mungkin dalam vesikula kecil (Sakaguchi et al., (1993). Selanjutnya penemuan identifikasi vakuolar Cryptococcus. Hasil ini memberikan bukti bahwa sintesis kapsul terjadi, minimal di bagian intraselular.

Di antara dua jenis serotipe D (24.067 dan 3501) meneliti ikatan mAb, pencatatan perbedaan kualitatif dan kuantitatif pada pola pengikatan antibodi. Perbedaan struktur GXM antar strain. Penelitian sebelumnya  tentang sel-sel yeast in vitro telah menunjukkan perbedaan signifikan antara polisakarida kapsuler dan suatu serotipe (Kecil et al., 1986) dan heterogenitas dalam serotipe pada  epitop reaktif dengan mAbs (Spiropulu et al., 1989). Struktur GXM ini sangat bervariasi antara strain-strain yang ada dan bahkan individu dapat menghasilkan berbeda jenis GXM tergantung pada fenotipe (Fries et al., 1999).

Pada penelitian ini telah ditemukan dinding sel berlabel Cap 67 dengan 13F1 mAb, meskipun bukan mAbs 2H1 atau 12A1. Ketiga mAbs dihasilkan dari limpa dari GXM tetanus toksoid immunized mouse. mAbs 13F1 12A1 dan berasal dari klon sel B (Mukherjee et al., 1993), tetapi berbeda spesifisitasnya, pola interaksi pada sel yeast dan pelindung efficacy (Mukherjee et al., 1993, 1995). Meskipun mekanisme dan gen yang terlibat dalam sintesis kapsuler untuk beberapa penelitian (Chang et al., 1996; Doering, 1999), dasar molekuler adanya kapsul yang mutan tidak diketahui (Fromtling et al., 1982; Jacobson et al, 1982.). Penelitian ini menunjukkan bahwa epitope dikenali oleh mAb 13F1 dihasilkan oleh mutan, meskipun pelabelan kurang kuat dari galur induk isogeniknya. Catatan mutan ini mungkin ada di bagian tertentu, kemampuannya untuk ekspor komponen polisakarida ini melalui dinding sel, meskipun label kecil itu ditemukan dalam jaringan yang berdekatan, namun kenyataannya ini  tidak terjadi. Namun, dikenali oleh epitope mAbs 2H1 dan 12A1, yang mirip, jika tidak identik,  tidak ditemukan di Cap 67, menunjukkan bahwa sintesis dari bentuk epitope untuk mAbs ini rusak pada komponen GXM. Hasil ini menimbulkan kemungkinan bahwa epitop dikenali oleh Abs 13F1 12A1 dan berada di berbagai molekul GXM, suatu penemuan yang akan berarti bahwa lebih dari satu jenis molekul GXM dihasilkan oleh beberapa strain C. neoformans.

KESIMPULAN

Penelitian ini menunjukkan bahwa infeksi C. neoformans pada murin adalah proses yang sangat dinamis dimana karakteristik morfologi sel-sel yeast berbeda  fungsi dari umur infeksi. Perbedaan signifikan antara sel yeast yang diteliti secara in vitro dan pertumbuhan populasi sel yeast  yang muncul dalam jaringan selama infeksi kronis. Meskipun telah diakui selama beberapa dekade bahwa infeksi telah menghasilkan perubahan morfologi oleh peningkatan ukuran sel kapsul dan ketebalan dinding sel, namun terjadinya perubahan lain dalam karakteristik selular tidak diakui secara luas.