Isolasi Enterobacter sakazakii dan Enterobacter sp. pada Lingkungan dan Produksi Pangan

Abstrak
Enterobacter sakazakii dan Enterobacter sp lainnya telah menyebabkan penyakit Foodborne yang ditularkan melalui konsumsi berbagai makanan, termasuk makanan bayi. Prevalensi E. sakazakii dan Enterobacter sp. dalam makanan bayi dan susu formula, susu bubuk, produk sereal, rempah-rempah, gula dan lingkungan produksi pangan dipelajari. Sebanyak 106 sampel yang diuji terhadap E. sakazakii dan Enterobacter sp. Keberadaan E. sakazakii dan Enterobacter sp. dideteksi dengan menggunakan prosedur Enrichment FDA dan media chromogenic. E. sakazakii ini terisolasi dari 2/15 makanan formula bayi, 2/8 susu formula bayi, dan 1/18 produk sereal.
Namun tidak satu pun dari susu bubuk, rempah-rempah, gula dan lingkungan sampel positif terhadap E. sakazakii. E. agglomerans ini terisolasi dari formula makanan bayi, susu formula bayi, susu bubuk, produk-produk sereal, rempah-rempah dan sampel lingkungan. E. cloacae terisolasi dari susu formula bayi.

1.Pendahuluan
Enterobacter sakazakii adalah Gram negatif, fakultatif, dan bakteri berbentuk batang. Famili Enterobacteriaceae dan genus Enterobacter yang terdiri dari beberapa spesies termasuk E. agglomerans, E. cloacae, E. aerogenes dan E. gergoviae. Perbedaan di antara spesies-spesies ini adalah didasarkan pada reaksi biokimia, dan serologi dan teknik molekuler (Farmer, Asbury, Hickman, & Brenner, 1980; Petani & Kelly, 1992; Hovmann & Roggenkamp, 2003; Iversen, Waddington, Aktif, & Forsythe, 2004d). E. sakazakii, E. agglomerans, dan E. cloacae yang dianggap sebagai spesies utama dari genus ini yang sering terisolasi dari sampel klinis dan produk makanan (Farmer et al., 1980).
E. sakazakii dianggap sebagai bakteri patogen oportunistik yang menyebabkan colonecrotosis (Van Acker et al., 2001) dan meningitis (Bar-Oz, Preminger, Peleg, Block, & Arad, 2001) terutama pada neonatal dengan angka kematian bervariasi antara 40% hingga 80% (Muytjens, Roelfos, & Jaspar, 1988). The Commission for Microbiological Specification for Foods (ICMSF, 2002) meranking E. sakazakii sebagai “satu hal yang berbahaya untuk masyarakat, yang mana telah mengancam kehidupan dalam jangka panjang".
Enterobacter sakazakii dan Enterobacter sp telah dilaporkan diisolasi dari lingkungan yang berbeda diantaranya adalah tanah, tikus, lalat, pabrik susu bubuk, pabrik coklat dan rumah tangga (Kandhai, Reij, Gorris, Guillaume - Gentil, & Van Schothorst, 2004a; Neelam, Nawaz, & Riazuddin, 1987). E. sakazakii juga telah di isolasi dari berbagai macam makanan termasuk suhu ultra-tinggi diperlukan susu (susu UHT), keju, daging, sayuran, biji-bijian, sorgum biji, bibit padi, tumbuh-tumbuhan, rempah-rempah, roti difermentasi, minuman fermentasi, tahu, dan asam teh (Gassem, 1999, 2002; Iversen dan Forsythe, 2003, 2004a; Leclercq, Wanequ, & Baylac, 2002; Muytjens et al., 1988; Skaldal, Mascini, Sal Vadori, & Zannoni, 1993). Meskipun demikian, penelitian ini berhubungan antara infeksi E. sakazakii neonatal dan susu formula bayi (Biering, arlsson,Clark, Jonsdottir, & Ludvigsson, 1989; Muytjens et al., 1988; Nazarowec-White & Farber, 1997b; Simmons, Gelfand, Haas, Metts, & Feruson, 1989; van Acker et al., 2001). US Food and Drug Administration (FDA, 2002) telah mengingatkan agar melakukan perawatan kesehatan yang profesional karena terkait resiko terhadap infeksi E. sakazakii pada neonatal yang diberi susu formula bayi. Kewaspadaan dalam menghindari infeksi E. sakazakii pada bayi prematur dan neonatal adalah dengan melakukan pencegahan terhadap kontaminasi susu formula bayi selama produksi dan persiapan botol. Namun, pengetahuan tentang etiologi dan karakteristik ekologi E. sakazakii di pabrik-pabrik yang memproduksi susu formula dan di dapur rumah sakit belum diteliti secara mendalam.
Tujuan penelitian ini adalah untuk menyelidiki prevalensi E. sakazakii dan Enterobacter sp. komersial produk makanan termasuk formula makanan bayi, susu formula bayi, susu bubuk, produk-produk sereal, rempah-rempah, dan gula dan di dua pabrik yang memproduksi makanan dan susu formula produk sereal.
2. Bahan dan Metode
Semua media bahan yang digunakan dalam penelitian ini di peroleh dari Oxoid, Inggris.
2.1. Sampel Makanan
Total dari sebanyak 59 sampel makanan komersial dari pabrik yang berbeda tersebut dibeli dari toko-toko eceran di Yordania. Yang terdiri dari 15 sampel makanan bayi (direkomendasikan untuk bayi di atas 6 bulan), 8 susu formula bayi (disarankan untuk bayi umur hingga 1 tahun), 10 susu bubuk full cream, 18 sereal produk,
rempah 5 dan gula 3. Sampel makanan dibuat atau dikemas dari 13 negara yang berbeda.
2.2. Sampel dari lingkungan produksi pangan
Sebanyak 47 sampel swab diperoleh dari formula dan pabrik makanan sereal bayi dengan menggunakan kapas kering yang steril. Sampel tersebut dikumpulkan dari daerah produksi, termasuk bubuk, dinding, peralatan dan menumpahkan produk kering.
2.3. Deteksi, isolasi dan identifikasi dari Enterobacter sp.
Prosedur dari FDA (2002) untuk deteksi, isolasi, dan identifikasi E. sakazakii dan Enterobacter sp. dalam makanan dan lingkungan yang ada dalam sampel. Sepuluh mili liter aliquot dari sampel homogen, (10 g bubuk per 90 ml Peptone steril) atau sampel usap ditambahkan untuk 90 ml Enrichment Broth (EE broth) yang berisi empedu garam dan brilian hijau untuk menekan pertumbuhan non-Enterobacteriaceae. Botol-botol itu kemudian diinkubasi selama 14 - 16 jam pada 36 °C. Glukosa Violet Red Bile Agar (VRBGA) (0.1ml) dalam 2 cawan petri diinokulasi dengan metode garis dari biakan EE kaldu. Loopful lain dari suspensi ini hilang pada VRBGA. Cawan yang diinkubasi selama 14 - 16 jam pada 36 °C. Lima koloni dari koloni merah atau ungu dikelilingi oleh warna ungu diperiksa morfologinya. E. sakazakii dan Enterobacter sp. yang tumbuh di
VRBGA akan tampak di bawah mikroskop sebagai batang pendek dan Gram negatif. Koloni khas bergaris-garis pada Tryptic Soya Agar (TSA), cawan yang diinkubasi selama 24 - 72 jam pada 25 °C. Koloni yang terisolasi menghasilkan pigmen kuning itu diidentifikasi dengan menggunakan API 24E tes. Untuk menghindari kekurangan dari prosedur FDA terhadap isolasi spesifisitas E. sakazakii (Iversen et al., 2004), isolat E. sakazakii dalam medium Druggan-Forsythe-Iversen (DFI) dapat tumbuh. E. sakazakii ATCC 51.329 digunakan sebagai kontrol positif, demikian halnya pada isolate non- E. sakazakii juga teridentifikasi.

3. Hasil dan diskusi
3.1. Isolasi Enterobacter sp. dari makanan komersial sampel
3.1.1. Tabel 1Susu formula
Identifikasi dari E. sakazakii dan Enterobacter sp. dalam makanan bayi dan sampel susu formula. 17,4%, 20% dan 17,4% dari sampel ditemukan positif terhadap E. sakazakii, E. cloacae dan E. agglomerans. Strain positif terhadap E. sakazakii membentuk koloni-koloni kuning pada TSA setelah 24-72 jam dari inkubasi pada 25 °C dan koloni biru-kehijauan setelah 24 jam dari inkubasi pada 37 °C pada media DFI. Hasil tersebut diharapkan tetap konsisten dengan orang lain yang telah menemukan hubungan langsung antara susu formula dan E. sakazakii (Biering et al., 1989; Iversen dan Forsythe, 2003; Muytjens et al., 1983; Nazarowec-White & Farber, 1997b; Noriega, Kotloft, Martin, & Schwalb, 1990; Simmons et al., 1989). Muytjens dkk (1988) menguji 141 sampel bubuk susu formula bayi yang diproduksi di negara-negara yang berbeda. Mereka menemukan bahwa E. sakazakii dan Enterobacteriaceae terisolasi dari 14,1% dan 52,2% dari total sampel, masing-masing. Nazarowec-White dan Farber (1997b) mengamati kehadiran E. sakazakii pada 120 sampel susu formula kering untuk bayi yang diperoleh dari Kanada dan melaporkan bahwa prevalensi bakteri ini berkisar antara 0% dan 12% dari sampel/produsen. Iversen dan Forsythe (2004a) terisolasi E. sakazakii dari 2,4% dari 82 susu formula bubuk bayi.
Banyak penelitian tentang susu formula sebagai sumber pathogen yang serius (Blok et al., 2002; Muytjens et al., 1988; Nazarowec-White & Farber, 1997b;
Postupa & Aldova, 1984; van Acker et al., 2001). Meskipun kenyataannya bahwa formula yang mendapat perlakuan treatment panas, selama pengolahan E. sakazakii masih terisolasi dari produk tersebut. Pengolahan pasca kontaminasi pada susu formula dari lingkungan produksi pangan mungkin bertanggung jawab untuk keberadaan kuman patogen dalam susu formula.

Table 1
Enterobacter sakazakii and other Enterobacter sp. isolated from powdered infant food and milk formula and related foods
Food samples Number of samples Enterobacter sp.
E. sakazakii
E. cloacae. E. agglomerans
Infant food formula 15 +(2/15) +(3/15) +(2/15)
Infant milk formula
8 +(2/8) - +(2/8)
Milk powder
10 - - +(2/10)
Cereal products
Starch
3 - -
Emolina
3 +(1/3) - +(1/3)

Bread crumbs
3 - - -
Oat 3
3 - - -
Ground rice
S 3 - - -
Flour
3 - - +(1/3)
Mixed spices
5 - - +(1/3)
Fine sugar
3 - - -

Nazarowec-White dan Farber (1997a) menyatakan bahwa E. sakazakii
akses ke bubuk dari lingkungan atau dari penambahan bahan pada tahap pengolahan bubuk. Iversen dan Forsythe (2003) melaporkan bahwa kehadiran
E. sakazakii dalam susu bubuk formula bayi tergantung pada kondisi proses dan sifat produk.
E. sakazakii bukanlah satu-satunya spesies yang terisolasi dari
formula bayi, tetapi juga, spesies lain dari genus yang sama terdeteksi dalam beberapa sampel, yaitu, E. cloacae dan E. agglomerans. E. cloacae yang terisolasi dari tiga
sampel (formula makanan bayi), dan E. agglomerans ini terisolasi
dari empat sampel (2 dari makanan formula bayi dan 2 dari susu formula bayi). Organisme ini, dikelompokkan B, yang berkaitan dengan infeksi neonatal yang
termasuk necro-entercolitis, penyakit gastrointestinal penting yang paling umum pada bayi baru lahir. (FAO / WHO, 2004; Iversen & Forsythe, 2004b). FAO/WHO
(2004) telah menyatakan "Enterobacteriaceae lain termasuk dalam kelompok "B" karena mereka menyebabkan sakit pada bayi (misalnya infeksi sistemik, NEC dan diare parah) dan telah ditemukan dalam susu formula bubuk, tetapi susu bubuk formula belum menunjukkan adanya kontaminasi, baik secara epidemiologi atau microbiologi, sebagai mediator dan sumber infeksi pada bayi. Organisme ini meliputi, misalnya: Enterobacter agglomerans, Hafnia alvei, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter koseri, C. freundii, oxytoca Klebsiella dan Enterobacter cloacae. Berbagai organisme tersebut mencemari produk bisa secara tidak sengaja tergantung pada kondisi higienis lingkungan produksi (Lehner & Stephan, 2004).

3.1.2. Susu bubuk
E. sakazakii tidak terisolasi dari setiap sampel susu bubuk (Tabel 1). Namun, E. agglomerans ditemukan 20% dari sampel. Keberadaan E. sakazakii dalam produk adalah satu hal yang tidak mungkin karena susu cair biasanya dipasteurisasi sebelum pembuatan susu bubuk. Telah dilaporkan bahwa perlakuan pasteurisasi efektif dalam menjaga higien susu terhadap agen patogen tersebut (Iversen et al., 2004c; Nazarowec - Putih, McKellar, & Piyasena, 1999). Nazarowec -White dan Farber (1997c) menemukan bahwa E. sakazakii ini lebih panas-sensitif daripada organisme patogen lain seperti Listeria monocytogenes.
Meskipun tidak terdeteksi dalam sampel susu bubuk, E. sakazakii tidak diabaikan dari kehidupan seseorang, karena kemungkinan muncul, dengan pertimbangan bahwa setiap sampel mewakili dirinya sendiri saja. E. sakazakii telah terisolasi dari susu bubuk (Farmer et al., 1980; Iversen & Forsythe, 2004a). Potensi susu bubuk yang akan terkontaminasi harus diakui, baik secara langsung atau melalui permukaan dan peralatan yang mungkin terkontaminasi dengan E. sakazakii setelah berhubungan dengan susu mentah (Iversen & Forsythe, 2004a). Uni Eropa, kriteria mikrobiologis susu serbuk untuk pengujian Enterobacteriaceae (Anonymous, 2005) memerlukan <10 cfu/g of powder (nD5,cD0m<10cfu/g).

3.1.3. Produk sereal
Deteksi dan isolasi E. sakazakii dan Enterobacter sp. dari sampel produk sereal yang berbeda terlihat pada Tabel 1. E. sakazakii ini terisolasi dari 33,3% dari sampel semolina (hancur gandum) dan E. agglomerans ini terisolasi dari 33,3% dari pati, semolina, tepung dan dicampur sampel rempah-rempah. Hasilnya luar biasa karena E. sakazakii telah diisolasi dari berbagai makanan termasuk keju, roti yang difermentasi, tahu, teh asam, semur daging, biji beras, wijen biji-bijian, kacang tanah, jagung, beras tanah, dan almond (Cottyne et al., 2001; Iversen & Forsythe, 2004a), selain itu juga telah ditemukan dalam khamir roti karena organisme menjadi bagian dari permukaan benih sorgum (Gassem, 1999). Hal ini di percaya bahwa E. sakazakii dapat ditemukan pada bahan makanan, namun, ini belum diselidiki secara rinci.
Table 2
Enterobacter sakazakii and other Enterobacter sp. isolated from environmental samples of infant formula and cereal products factories

Environmental samples Number of samples Enterobacter sp
Infant formula factory
E. sakazakii
E. cloacae E. agglomerans

Floors 7 - - +(3/7)
Walls
4 - - +(1/4)
Spilled products
3 - - -
Equipment
Hopper
2 - - +(1/2)
Sieve
2 - - -
Vibrator 2 - - -
Twin head device
2 - - --
Conveyer device
4 - - +(1/4)
Cereal products factory
Floors 7 - - +(2/4)
Walls 4 - - -
Equipment
Roller 2 - - +(1/2)
Shaker 2 - - -
Mixer 2 - - +(1/2)
Conveyer 4 - + + (1/2)

.3.2. Isolasi Enterobacter sp. dari lingkungan pabrik.
3.2.1. Pabrik susu formula
Sampel swab dianalisis untuk kehadiran E. sakazakii dan Enterobacter sp. (Tabel 2). E. sakazakii tidak terisolasi dari salah satu sampel yang dikumpulkan dari pabrik E. agglomerans adalah satu-satunya spesies yang terisolasi dari 35,3% dari sampel. Nazarowec-Putih dan Farber (1997a) menyatakan bahwa pengolahan lingkungan dan bahan berperan utama dalam kontaminasi susu formula bayi dengan mikroorganisme patogenik. E. sakazakii dan Enterobacter sp lain. telah dilaporkan sebagai terisolasi dari pengolahan makanan lingkungan pabrik susu (Bar-Oz et al., 2001; Noriega dkk, 1990; Skaldal et al., 1993). Lingkungan pabrik susu bubuk dan formula bayi telah dipelajari secara ekstensif (Bar-Oz et al., 2001; Kandhai et al., 2004a, 2004b). E. sakazakii dan Enterobacter sp. terisolasi dari lokasi yang berbeda termasuk bubuk, hasil goresan, kebersihan peralatan (Kandhai et al., 2004a), ruang pengering dan pengisian (Caric, 1993) serta blender yang digunakan untuk menyiapkan formula rehydrated (Bar-Oz dkk., 2001). Meskipun penelitian ini diambil dari pabrik yang sama atau tempat-tempat yang serupa dengan yang dilaporkan tercemar, namun tidak ada yang mengandung E. sakazakii.

3.2.2. Produk Pabrik Sereal
E. sakazakii tidak terisolasi dari setiap sampel yang dikumpulkan dari pabrik (Tabel 2). E. cloacae dan E. agglomerans adalah isolasi utama dari 38,5% sampel yang ada. Kandhai et al. (2004a) mengisolasi E. sakazakii dari sampel yang diperoleh dari pabrik-pabrik makanan yang berbeda. Mereka menemukan bahwa 21%, 25%, 44%, dan 27% dari sampel positif untuk bakteri dalam susu bubuk, coklat, sereal, produk tepung kentang dan pabrik-pabrik. Umum, kehadiran E. sakazakii di lingkungan pabrik menggambarkan rendahnya kondisi higienitas dan kontaminasi silang (Gurtler, Kornacki, & Beuchat, 2005).

4. Kesimpulan
Hasil studi ini menunjukkan bahwa E. sakazakii ini ditemukan dalam susu formula dan semolina sampel. Spesies Enterobacter seperti E. cloacae dan E. agglomerans terisolasi dari susu formula dan sampel produk sereal. E. agglomerans diisolasi dari susu bubuk dan lingkungan sampel.
Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan kondisi-kondisi yang mempengaruhi kelangsungan hidup dan pertumbuhan E. sakazakii dalam kondisi kering dan dilarutan susu formula. Selain itu, studi-studi tentang kondisi yang mempengaruhi pembentukan biofilm oleh E. sakazakii di pabrik makanan dan pengaturan rumah sakit diperlukan.